Falha na sexagem por inibição do desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro com anticorpos anti H-Y / Failure of sexing by developmental arrest of bovine embryos in vitro produced with H-Y antisera

Embriões bovinos produzidos in vitro, em estádio de mórula, foram cultivados em meio contendo anticorpos anti H-Y de alto título proveniente de ratos por 24h e, após este tempo, classificados em dois grupos: 1) embriões inibidos em estádio de mórula (classificados como machos) e 2) embriões que se desenvolveram e formaram a blastocele (classificados como fêmeas). O sexo de 311 embriões, distribuídos em três grupos de concentração dos anticorpos, 3 por cento, 5 por cento ou 7 por cento, foi identificado pela reação em cadeia da polimerase. Não houve desvio da proporção entre machos e fêmeas (P>0,05) nos grupos em que se utilizaram os anticorpos anti H-Y, quando comparadas ao grupo-controle, sem adição de anticorpos anti H-Y. Diferentemente dos resultados obtidos utilizando-se embriões bovinos produzidos in vivo, a sexagem com anticorpos anti H-Y de alto título em embriões produzidos in vitro não propiciou sucesso.

In vitro produced bovine embryos at morula stage were cultured in medium containing high titer of rat H-Y antisera for 24h. The embryos were classified in two groups: 1) embryos arrested at morula stage (classified as males); and 2) embryos that developed and formed a blastocoele (classified as female). The sex of 311 embryos, divided in three groups of concentration of H-Y antisera, 3 percent, 5 percent or 7 percent, was identified by polimerase chain reaction. The results showed no difference (P>0.05) on sexual deviation in groups in which the H-Y antisera was added, in relation to control group, in which no H-Y antisera was added. In contrast with results obtained with in vivo produced bovine embryos, the sexing of in vitro produced bovine embryos with high H-Y antisera titer did not succed.

Oocyte activation and preimplantation development of bovine embryos obtained by specific inhibition of cyclin-dependent kinases

The efficiency of bohemine and roscovitine in combination with ionomycin on parthenogenetic activation and initial embryonic development of bovine oocytes was studied. Two experiments were performed: in the first, different concentrations (0, 50, 75 or 100æM) and different exposure periods (2, 4 or 6 hours) to bohemine or roscovitine were tested for activation rates of in vitro matured (IVM) bovine oocytes, which were pre-exposed to ionomycin. The best treatments, 75µM bohemine and 50µM roscovitine, both for 6h, were used in the second experiment, in which IVM bovine oocytes were exposed to ionomycin, followed or not by bohemine or roscovitine treatment, and evaluated for nuclear status, activation rate and blastocyst development were assessed. The combined treatments (ionomycin + cyclin-dependent kinases inhibitors - CDKIs) showed better results for activation rates (77.3 percent) and initial embryonic development (35.2 percent) than the single ionomycin treatment (69.4 percent for activation and 21.9 percent for development); and also lead to a more uniform activation (nearly 90 percent single pronucleus development). The results showed that CDKIs improve the effects of ionomycin on parthenogenetic activation and blastocyst development in bovine oocytes and could help to achieve more efficient activation protocols, increasing the developmental competence of embryos obtained by reproductive biotechniques.

Realizaram-se dois experimentos para avaliar a eficiência da bohemina e roscovitina associadas à ionomicina para ativação partenogenética e desenvolvimento embrionário inicial de bovinos. No primeiro, foram testadas diferentes concentrações (0, 50, 75 ou 100æM) e diferentes tempos de exposição (2, 4 ou 6 horas) à bohemina ou à roscovitina na ativação de oócitos bovinos maturados in vitro (MIV) pré-expostos à ionomicina. Os melhores tratamentos, bohemina 75µM e roscovitina 50µM, ambos por seis horas, foram utilizados no segundo experimento, no qual oócitos bovinos MIV foram expostos à ionomicina seguido ou não pelo tratamento com inibidores específicos das quinases dependentes de ciclina (CDKI), e avaliados quanto à configuração nuclear, taxa de ativação e desenvolvimento até blastocisto. Os tratamentos combinados (ionomicina+CDKI) apresentaram melhor taxa de ativação (77,3 por cento) e desenvolvimento embrionário inicial (35,2 por cento) do que a ionomicina sozinha (69,4 por cento e 21,9 por cento, respectivamente), e também promoveram ativação mais uniforme (aproximadamente 90 por cento de formação de um pronúcleo). Estes resultados demonstram que os CDKIs potencializam o efeito da ionomicina na ativação e desenvolvimento embrionário inicial e podem auxiliar na obtenção de protocolos de ativação mais eficientes, aumentando a capacidade de desenvolvimento de embriões produzidos por meio de biotécnicas reprodutivas.

Effect of concentration and exposure period to butyrolactone I on meiosis progression in bovine oocytes

The effect of concentration and exposure period of bovine oocytes to butyrolactone I (BLI) on meiotic block and in vitro maturation (IVM) kinetics was studied. In experiment 1, all oocytes were at germinal vesicle stage (GV), after 6h in culture with 0, 50 and 100æM BLI. After 12h, all oocytes cultured with 50 and 100æM BLI remained in GV. After 24h, less oocytes were in GV with 50æM (82 percent) than with 100æM BLI (99 percent, P<0.05). In experiment 2, after 6h IVM, 93 percent of control oocytes (IVM only) were in GV, while treated oocytes (100æM BLI for 6, 12 or 24h prior to IVM) showed less oocytes in GV with increased exposure period to BLI prior to IVM (83 and 73 percent, for 6h and 12h, P<0.05). For a 24h inhibition, GV rates were similar to 12h (70 percent, P>0.05). After 18h IVM, metaphase II (MII) rates were similar for all groups (76-81 percent). In experiment 3, after 6h IVM, 74 percent of treated oocytes (50 or 100æM BLI for 12h) were in GV. This rate was lower than for control oocytes (97.3 percent, P<0.05). After 18h IVM more oocytes (~80 percent, P>0.05) were in MII with BLI than for control (73 percent, P<0.05). Shorter culture periods require lower BLI concentration for meiotic block; initial nuclear maturation kinetics of oocytes cultured with BLI is accelerated, and this is affected by culture period but not by drug concentration.

Estudou-se o efeito da concentração e do tempo de exposição à butirolactona I (BLI) no bloqueio meiótico e na cinética da maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos. No experimento 1, todos os oócitos encontravam-se em vesícula germinativa (VG) após 6h de cultivo nas concentrações de 0,50 e 100æM BLI. Após 12h, somente oócitos cultivados com BLI (50 e 100æM) estavam em VG. Após 24h, menos oócitos tratados com 50æM (82 por cento) estavam em VG em relação a 100æM (99 por cento, P<0,05). No experimento 2, após 6h de MIV, 93 por cento dos controles (somente MIV) estavam em VG, enquanto que nos tratados (100æM BLI por 6, 12 ou 24h pré-MIV), menor proporção de oócitos permaneceu nesse estádio com o aumento do tempo de exposição à BLI antes da MIV (83 e 73 por cento para 6 e 12h, P<0,05). Com 24h de exposição, a taxa de VG foi similar à de 12h (70 por cento, P>0,05). A taxa de metáfase II (MII, 76-81 por cento) foi similar para todos os tempos de exposição, após 18h de MIV. No experimento 3, após 6h de MIV, menos oócitos tratados (74 por cento para 50 ou 100æM BLI por 12h) estavam em VG comparados aos controles (97 por cento, P<0,05). Após 18h de MIV, mais oócitos estavam em MII com BLI (~80 por cento, P>0,05) do que os controles (73 por cento, P<0.05). Conclui-se que para cultivos mais curtos, a concentração mais baixa de BLI bloqueia a meiose a cinética da maturação nuclear é acelerada em oócitos expostos à BLI e isso é afetado pelo tempo de cultivo, mas não pela concentração da droga.

Activation of bovine oocytes by strontium combined or not with an electric pulse

O objetivo deste trabalho foi avaliar as taxas de ativaçäo e de clivagem de oócitos bovinos tratados com estrôncio (10mm de SrCl2), após maturaçäo in vitro por 27-28 horas. No experimento 1, os tratamentos foram: S4 - ativaçäo pelo estrôncio por 4 horas; S12 - ativaçäo pelo estrôncio por 12 horas; S30 - ativaçäo pelo estrôncio por 30 horas; e P - ativaçäo por pulso elétrico (3 pulsos de 1,0kv/cm). No experimento 2 os tratamentos foram: PS4 - ativaçäo combinada pelo pulso elétrico e pelo estrôncio por 4 horas; S4P - ativaçäo pelo estrôncio por 4 horas e pelo pulso elétrico; e PS30 - ativaçäo pelo pulso elétrico e pelo estrôncio por 30 horas. No experimento 1, todos os tratamentos apresentaram taxas similares de ativaçäo (83-90 por cento; P>0,05). Para clivagem, P foi melhor (53 por cento; P<0,05) do que todos os tratamentos com estrôncio (6 a 28 por cento). No experimento 2, o tratamento S4P apresentou melhor taxa de ativaçäo (88 por cento; P<0,05) do que PS4 e PS30 (60 e 68 por cento, respectivamente). Para clivagem, observou-se o mesmo padräo, S4P (65 por cento; P<0,05) e PS4 e PS30 (37 por cento e 44 por cento, respectivamente). Conclui-se que o estrôncio é capaz de ativar oócitos bovinos e sua combinaçäo com pulso elétrico näo melhora a ativaçäo. Este é o primeiro relato demonstrando que o estrôncio ativa oócitos bovinos.